Beschreibung
Primäre humane Hepatozyten sind, vor allem aufgrund zum Teil großer Speziesunterschiede, weiterhin das in vitro System der Wahl, um leberspezifische Prozesse und Funktionen zu analysieren. In einem zweidimensionalen Kultursystem mit einer optimalen, chemisch definierten und serumfreien Umgebung, in der mehrere der arzneimittelmetabolisierenden Cytochrom P450-Enzyme und leberspezifischen Transkriptionsfaktoren lange exprimiert bleiben, wurden humane Hepatozyten über mehrere Wochen kultiviert. Dabei blieben die hepatozellulären Funktionen der anabolen Albuminsynthese und der katabolen Harnstoffproduktion auf einem konstant hohen Niveau. Die Zugabe der Wachstumsfaktoren HGF und EGF erwies sich dabei als sehr förderlich zur Erhaltung dieser Funktionen.
Das System wurde zur repetitiven Analyse der Wirkung von Acetaminophen auf humane Hepatozyten und Rattenhepatozyten verwendet. Dabei erlaubte die nichtinvasive Bestimmung der Harnstoff- und Albuminkonzentration sowie der Lactatdehydrogenase-Aktivität im Zellkulturüberstand die kontinuierliche Überwachung der Kultur über mindestens zwei Wochen. Acetaminophen in einer Konzentration von 2815 mg/l (18,6 mM) bewirkte in humanen Hepatozyten innerhalb von 24 h eine Absenkung der Harnstoffmenge um etwa 25 % und des synthetisierten Albumins um ca. 70 % bei nicht erhöhter LDH-Aktivität. Ein bis drei Tage nach Entfernung der Substanz erreichten die Funktionen wieder das Niveau der Kontrollzellen. Die Analyse der Wirkungen von Acetaminophen auf den zellulären Metabolismus war repetitiv mit ähnlichen Ergebnissen über mehrere Zyklen jeweils im Abstand von vier Tagen möglich. Der Wirkstoff führte außerdem zu reversiblen und wiederholbaren ultrastrukturellen Modifikationen, insbesondere zu einem nahezu kompletten Austausch des rauen endoplasmatischen Retikulums gegen glattes ER und zu einem Abbau der Glycogenvorräte. Durch vergleichende Inkubationen von primären Rattenhepatozyten mit Acetaminophen wurde die unterschiedliche Empfindlichkeit der Leberzellen verschiedener Spezies belegt. Die in der Mehrzahl bisher veröffentlichter Studien nachgewiesene rasche Depletion des cytoplasmatischen Glutathions konnte in humanen Hepatozyten hier erst mit starker Verzögerung detektiert werden. Der Microarray offenbarte bereits bei einer nicht toxischen Dosis eine Expressionssteigerung Stress-induzierter Gene sowie eine Verlangsamung des zellulären Metabolismus. Im Gegensatz dazu wurde die c‑Jun Nterminale Kinase 2 als alleinige stress-aktivierte Proteinkinase erst bei toxischen Substanzkonzentrationen in Rattenhepatozyten deutlich induziert. Neben einer in der real-time PCR bestätigten deutlichen Senkung der Expression der Cytochrome CYP1A2 und CYP3A4 wurden auch die für die Albuminsynthese bedeutenden leberspezifischen Transkriptionsfaktoren HNF1 und HNF4α in ihrer Expression stark reduziert. Die massive Expressionssteigerung der bisher fast ausschließlich in Muskelzellen untersuchten Rad GTPase läßt eine Wechselwirkung von Acetaminophen bzw. seinen Metaboliten mit diesem Enzym vermuten, die einer näheren Charakterisierung bedarf.
Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten demonstrieren die Möglichkeit, das Kultursystem als Modell zur wiederholten Prüfung von fremdstoffinduzierten Veränderungen hepatozellulärer Funktionen einzusetzen und damit die Anzahl von Tierversuchen während der Wirkstoffentwicklung zu reduzieren.
Due to species differences, primary human hepatocytes are still the in vitro system of choice to analyse liver specific processes and functions. Human hepatocytes were cultured several weeks in an optimized, chemical defined and serum-free two-dimensional culture system. The expression of drug-metabolizing cytochrome P450 enzymes and liver-enriched transcription factors were maintained during culture. The anabolic albumin synthesis and catabolic urea production remained on a constant high level. The addition of growth factors HGF and EGF turned out to be very beneficial for maintaining these functions.
The system was used to study the effects of acetaminophen on primary human and rat hepatocytes. Non-invasive determinations of albumin, urea and lactate dehydrogenase concentrations in cell culture supernatants thereby allowed a continuous monitoring for at least two weeks. Acetaminophen in a concentration of 2815 mg/l (18.6 mM) reduced the urea production by 25 % and the albumin synthesis by approximately 70 % without any effects on cellular viability. After removal of the substance, hepatocellular functions reached the control level within one to three days. The repetitive analyses of acetaminophenmediated effects on cellular metabolism yielded to identical results for multiple cycles every four days. The drug also caused reversible and repetitive ultrastructural modifications, in particular an almost complete replacement of rough endoplasmic reticulum by smooth endoplasmic reticulum and a massive degradation of glycogen stores. The different sensitivity of species towards the active component was documented by comparing incubations with rat hepatocytes. So far the majority of published studies proofed a rapid depletion of cytosolic glutathione, which could only be detected here long delayed. The microarray displayed an increase in expression of stress-induced genes and a slowdown of cellular metabolism already with non-toxic concentrations. Opposite to this stands the exclusive induction of c‑Jun N‑terminal kinase 2 only with toxic concentrations in rat hepatocytes. Among the clear reduction of cytochrome CYP1A2 and CYP3A4 expression, the synthesis of liver-enriched transcription factor HNF1 and HNF4α important for functional albumin synthesis was highly downregulated by acetaminophen. The massive increase in expression of Rad GTPase, so far almost exclusively studied in muscle cells, suggests an interaction of the component or its metabolites with the enzyme, which needs to be further characterized.
The data shown in this thesis demonstrate the suitability of the culture system to serve as a model for repetitive testing of drug mediated changes on hepatocellular functions and thereby reducing animal studies during drug development.